Beispiele mikrobieller Biotransformationen

Mikroorganismen bilden drei Viertel der gesamten Biomasse auf der Erde und besiedeln praktisch jede ökologische Nische. So ist es nicht überraschend, dass aus terpenreichen Habitaten eine große Zahl an Bakterien und Pilzen isoliert wurden, die in der Lage sind, mit Hilfe bestimmter Enzyme ihres Stoffwechsels diese Naturstoffe umzuwandeln.
Dabei gibt es sowohl Mikroorganismen, die Terpene vollständig katabolisieren und als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle für ihr Wachstum nutzen können, als auch solche, die Terpene lediglich teilmetabolisieren bzw. funktionalisieren, d.h. im Sinne einer Biotransformation in strukturell verwandte Produkte umwandeln. Gerade bei Pilzen der Basidiomycota und Ascomycota finden sich viele Arten, die nach Terpendosierung interessante Biotransformationsprodukte bilden können.

Screening von Mikroorganismen

Die Arbeitsgruppe führt daher immer wieder auch mikrobiologische Screeningreihen mit entsprechender Produktanalytik durch, um solche Mikroorganismen zu identifizieren, die ein herausragendes Potenzial zur Umwandlung industriell interessanter Terpenleitstrukturen besitzen.
Aktuelle Arbeiten widmen sich insbesondere den Mono-, Sesqui- und Triterpenen, deren oxyfunktionalisierte Derivate für die Aroma-, Kosmetik- und Pharmaindustrie von Bedeutung sein können. So wurden beispielsweise erstmals filamentöse Pilze gefunden, die aus dem Monoterpen Linalool die Schlüsselaromastoffe des Fliederduftes, die sogenannten Fliederalkohole und -aldehyde, synthetisieren können, welche bis dato nur in der Pflanze beschrieben wurden.

Bestimmte Hefen wiederum zeigen die Fähigkeit, (+)-Limonen effizient regio- und steroselektiv zu hydroxylieren. Nach der Identifizierung eines terpenaktiven Mikroorganismus aus einem eigenen Screening oder auch auf Basis publizierter Daten schließen sich häufig Untersuchungen in Laborbioreaktoren an. Damit wird das natürliche Potenzial dieser Mikroorganismen zur Katalyse der gewünschte Reaktion unter optimierten Bioprozessbedingungen ausgelotet. Häufig ist es vorteilhaft die beteiligten Enzyme - in der Regel handelt es sich um Cytochrom P450 Monooxygenasen - zu isolieren und nach genetischer und biochemischer Charakterisierung in biotechnisch leichter zu handhabenden Wirtsorganismen wie Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae heterolog zu exprimieren.

Das Bakterium Pseudomonas putida eignet sich hervorragend zur Oxidation des monocyclischen Monoterpens (+)-Limonen zu (+)-Perillasäure, da es in Gegenwart hoher Konzentrationen des cytotoxischen Präkursors wachsen kann. Diese Biotransformation ist aus der Literatur bekannt. Hohe Konzentrationen der inhibierenden Perillasäure werden jedoch erst erreicht, wenn der Fed-batch Bioreaktorprozess mit einer kontinuierlichen in-situ Produktabtrennung (ISPR, in-situ product removal) auf Basis von Anionenaustauscherharzen gekoppelt wird. Derzeit wird untersucht, ob sich das Bakterium auch für andere Terpenbiotransformationen eignet.

Rekombinante E. coli Zellen, die eine gentechnisch evolvierte P450 Monooxygenase aus Bacillus megaterium überexprimieren, können  das bicyclische Monoterpen α-Pinen in wertvolle Aromastoffe und -vorstufen umwandeln. Hierzu wurde ein wässrig-organischer Zweiphasen-Bioprozess für die simultane in-situ Substratdarreichung und ISPR entwickelt.

Durch Klonierung einer heterologen Enzymkaskade zur Regeneration des zellulären Cofaktors NADPH wird der Ganzzellbiokatalysator noch leistungsfähiger. Der rekombinante Stamm stellt nun eine gute Ausgangsbasis für die heterologe Expression und biokatalytische Nutzung anderer NADPH-abhängiger Oxidoreduktasen dar.

Das methylotrophe Bakterium Methylobacterium extorquens besitzt die natürliche Eigenschaft, Carotinoide zu synthetisieren. Diese gehören zu den Isoprenoiden und zeichnen sich unter anderem durch eine intensive Rotfärbung aus. Bei entsprechender Prozessführung kann das Bakterium mit Methanol als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle zu hohen Zelldichten wachsen. Diese Fähigkeit sowie der etablierte molekularbiologische Zugang machenM. extorquens zu einer interessanten Alternative zu zuckerbasierten Fermentationsprozessen für die industrielle Biotechnologie

Hefen sind natürlicherweise eng assoziiert mit der Aromabildung in traditionellen Lebensmittelzubereitungen und besitzen daher ein großes Potenzial für die industrielle Aroma- und Riechstoffsynthese. Beispielsweise überführen sie Aminosäuren unter bestimmten Bedingungen über den Ehrlich-Stoffwechselweg in die korrespondierenden flüchtigen Alkohole und deren Acetatester.

Durch Optimierung der Nährmediums und der Prozessführung kann man Hefen, z.B. Kluyveromyces marxianus , zur Produktion unphysiologisch hoher Konzentrationen anregen, die jedoch sehr schnell eine inhibierende Wirkung entfalten. Erst durch Einsatz kontinuierlicher ISPR-Methoden, wie wässrig-organischer Zweiphasensysteme oder der membranbasierten organophilen Pervaporation, können beispielsweise die rosenartigen 2-Phenylethanol und 2-Phenylethylacetat ausgehend vom L-Phenylalanin in hohen Konzentrationen und hoher Reinheit gewonnen werden.

 Andere wertvolle Zielprodukte sind die kartoffelartig riechenden Methionol und 3-Methylthiopropylacetat, die aus L-Methionin mittels molekularbiologisch optimierter Saccharomyces cerevisiae Stämme im spezifisch optimierten Bioprozess ebenfalls im Gramm pro Liter Maßstab gebildet werden können. Weiter wertvolle Aromastoffe leiten sich von ungesättigten Fettsäuren ab. Nach Überexpression der entsprechenden Gene des pflanzlichen Fettsäuremetabolismus kann S. cerevisiae beispielsweise zur Produktion von C6-Aldehyden und -Alkoholen aus Fettsäurehydroperoxiden umfunktioniert werden, die als "Grünnoten" für die Aromatisierung von Lebensmitteln und Getränken von Bedeutung sind. Die aktuellen Forschungsarbeiten konzentrieren sich auf das Metabolic Engineering von S. cerevisiae für die Etablierung mehrstufiger Biotransformationsreaktionen und die Entwicklung substrat- und produktspezifischer integrierter Bioprozesse. Auf diese Weise soll die Hefe als modellhafter Ganzzell-Biokatalysator für die Synthese einer Vielzahl von Aromastoffen sowie bioaktiver Naturstoffe im Allgemeinen genutzt werden.