|
|
|
|
Biokatalyse mit isolierten Enzymen
| Der Einsatz isolierter Enzyme im Enzymreaktor bietet gegenüber der Vewendung ganzer Zellen diverse Vorteile. Beispielsweise können Substrat und Enzymkonzentration im Enzymreaktor optimal eingestellt werden, während Transportlimitierungen durch zelluläre Membranen ausgeschlossen sind. Weiterhin kann eine Minderung der Produktausbeute durch Neben- oder Folgereaktionen des zellulären Metabolismus vermieden werden. Allerdings gilt es, häufig auftretende Nachteile, die beispielsweise die effiziente Gewinnung der Enzyme, ihre in vitro Stabilität sowie Abhängigkeit von Cofaktoren betreffen können, durch entsprechende molekularbiologische und verfahrenstechnische Maßnahmen zu adressieren. |
Carotinoidspaltende Dioxygenasen
Carotinoide werden in der Natur durch carotinoidspaltende Dioxygenasen (carotenoid cleavage dioxygenases, CCD) unter Verwendung molekularen Sauerstoffs hochspezifisch gespalten. Durch ihre unterschiedliche Substratspezifitäten und Regioselektivitäten übernehmen diese Enzyme eine Schlüsselfunktion für die initiale Weichenstellung bei der Biosynthese von Apocarotinoiden mit den unterschiedlichsten biologischen Funktionen. Die Tatsache, dass CCD neben Eisen im aktiven Zentrum keine Cofaktoren der Zelle benötigen, macht diese Enzyme zu interessanten Objekten für Studien zur angewandten in vitro Biokatalyse.
|
Carotenoid cleavage dioxygenases (CCD) spalten Carotinoide regiospezifisch.
Viele der Spaltprodukte sind interessant für die Aromaindustrie
|
|
 Orangefarbene Carotinoide werden selektiv gespalten
und entfärben sich dabei
|
Unser Modellenzym AtCCD1 aus Arabidopsis thaliana spaltet Carotinoide an den C9-C10- und C9'-C10'-Doppelbindungen, wodurch flüchtige C13-Norisoprenoide wie das veilchenartige β-Ionon, ein wertvoller natürlicher Aromastoff, entstehen. Mit dem partiellen Abbau der chromophoren Carotinoide geht eine Farbveränderung einher, die zur Entwicklung eines photometrischen Assays genutzt wurde. Damit ist eine effiziente parallelisierte Charakterisierung und Optimierung des in vitro Einsatzes der CCD möglich. Hierbei ist die Darreichung der Substrate in wässrig-mizellaren Reaktionssystemen unter Einsatz nichtionischer Tenside von besonderer Bedeutung. Die Vertiefung unseres Verständnisses zur Funktionsweise dieser noch jungen Enzymfamilie stehen im Mittelpunkt aktueller Forschungsarbeiten. Besonders wichtig sind dabei Konzepte für eine technische Nutzung, die auf die Vermittlung der hydrophoben Substrate an die gelösten Enzyme und die Steigerung der in vitro Enzymstabilität gerichtet sind. |
Chloroperoxidase
Das Enzym Chloroperoxidase aus dem filamentösen Pilz Caldariomyces fumago gilt als vielversprechender Biokatalysator für selektive Oxidationen. Das Enzym, das Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel verwendet, benötigt im Gegensatz zu vielen Oxygenasen keine Cofaktoren, eine vorteilhafte Eigenschaft für den in vitro Einsatz. Eine neue Entdeckung ist, dass CPO unter bestimmten Reaktionsbedingungen, z.B. unter Einsatz eines organischen Cosolvens, auch genutzt werden kann, um Monoterpene selektiv zu oxidieren bzw. halohydroxylieren. Die Produkte sind interessante Aromastoffe bzw. chirale Synthone.
|
Biotransformation von Monoterpenen mit Chloroperoxidase
aus Caldariomyces fumago
|
Mit einer neuartige Kultivierungsmethode verbesserten wir die Biomasse- und Enzymbildung des mycelartig wachsenden Pilzes C. fumago . Durch Zugabe von Mikropartikeln (z.B. Al2 O3 ) zu Submerskulturen bilden sich freie Hyphen statt Pellets. Dadurch werden die Zellen besser mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt und bilden mehr Biomasse und Enzyme. Das patentierte Verfahren wurde MPEC genannt ("Microparticle-enhanced Cultivation") und eignet sich auch für andere filamentöse Mikroorganismen. Aktuelle Forschungsaktivitäten widmen sich der weiteren Verbesserung sowohl der Enzymproduktion mit C. fumago als auch des technischen Reaktionssystems für den in vitro Einsatz der CPO.
|
  |
Mikroskopische Aufnahme von Caldariomyces fumago -Kulturen, die in Abwesenheit
(links) und in Anwesenheit von Al2 O3 -Mikropartikeln (rechts) inkubiert wurden.
|
P450 Monooxygenasen
Für die Biotechnologie der Terpene sind die Cytochrom P450 Monooxygenasen von zentraler Bedeutung. Sie sind in der Biosynthese an entscheidender Position für die Funktionalisierung der Terpenkohlenwasserstoff-Grundkörper verantwortlich und stellen durch regio- und stereoselektive Hydroxylierungen die Weichen für die große Diversität der terpenoiden Sekundärmetabolite. Deshalb widmet sich die Arbeitsgruppe den P450 Monooxygenasen nicht nur mit dem Ziel der Ganzzellbiotransformation sondern auch in Untersuchungen zur in vitro Biokatalyse. Eine Herausforderung ist hierbei die Tatsache, dass diese Enzyme den zellulären Cofaktor NAD(P)H und zumeist weitere Partnerproteine für den Elektronentransfer benötigen und häufig membranständig vorliegen. Diesbezüglich bilden cytosolisch gelöste Enzyme wie
- P450BM-3 (aus B. megaterium ; P450BM-3 Muteine können Terpene oxidieren),
- P450cam (aus Pseudomonas putida ; P450cam oxidiert Campher) und
- P450cin (aus Citrobacter braakii ; P450cin oxidiert Cineol)
eine Ausnahme. Mit diesen Modellenzymen werden deshalb Studien zur in vitro Biokatalyse durchgeführt, wobei die Elektrochemie eingesetzt wird, um NAD(P)H als Quelle der Reduktionsäquivalente zu ersetzen. Damit wäre der Einsatz des Cofaktors vollständig zu umgehen, der für eine technische in vitro Anwendung zu teuer ist. Erste Ergebnisse zeigen, dass mit P450BM-3, welches durch Einbettung in ein leitfähiges Polymer auf einer Elektrode immobilisiert wurde, eine elektrochemisch angetriebene Biokatalyse möglich ist. Aktuelle Arbeiten richten sich auf die Verbesserung der Enzymanbindung sowie die Steigerung der volumetrischen Produktivitäten. Hierbei kommen auch Redoxmediatoren zum Einsatz, die die Elektronen zwischen Elektrode und aktivem Zentrum vermitteln.
|
| Die Entwicklung erster elektrochemisch kontaktierter Mikrotiterplatten (eMTP) soll zudem mittelfristig die Charakterisierung und Optimierung des artifiziellen Elektronentransfers zu Cofaktor-abhängigen Oxygenasen im parallelisierten Assay ermöglichen. |
 Elektrochemisch kontaktierte Mikrotiterplatte (eMTP)
|
|
© DECHEMA e.V. 1995-2010, Last update 12.03.2010 |
|
|
|
Institutsseminare im Winterhalbjahr 2009/2010
Mehr
|
Offene Stellen am Karl-Winnacker-Institut
Mehr
|
|
|
Gentechnikrecht: Gefährdungspotentiale, Sicherheitsmaßnahmen und Rechtsvorschriften
Staatlich anerkannte Fortbildungsveranstaltung für Projektleiter und BBS gemäß § 15 GenTSV Mehr
|
Sicherheitstechnik in der Chemischen Industrie
Anerkannt als Weiterbildungskurs für Störfallbeauftragte im Sinne der 5. BImSchV Mehr
|
Aspekte der Prozessintensivierung
Mehr
|
|
|
|
|
